赤芍、甘草等中藥合劑治急性荨麻疹機理的實驗研究

　　摘要目的赤芍、甘草等中藥合劑(簡稱抗敏口服液)治療急性荨麻疹的機理。方法①動物實驗：肥大細胞脫顆粒實驗，被動皮膚過敏實驗；②實驗室檢測：雙抗體夾心ELISA法檢測急性荨麻疹患者治療前後IL－2、IL－4水平。結果抗敏口服液組肥大細胞脫顆粒百分數及吸光度值明顯低於其它各組藥物（P＜0.01），抗敏口服液可使急性荨麻疹患者體內升高的IL－4及降低的IL－2恢復到正常。結論抗敏口服液可穩定肥大細胞膜、抑制抗原抗體結合、調整IL－2和IL－4濃度，對急性荨麻疹有較好的治療效果。

        我們在臨床上用赤芍、甘草等中藥合劑(簡稱抗敏口服液)治療急性荨麻疹患者，取得了較好療效，為進一步研究其治療機理，我們作了一系列動物實驗和臨床試驗，現將結果報道如下。材料和方法（一）實驗材料：抗敏口服液由四川泰華制藥有限公司提供，批號980901。由赤芍、甘草等中藥組成。赤芍、地龍、甘草、赤芍＋甘草、赤芍＋甘草＋地龍各100mL，相當於生藥220g，由泸州醫學院藥劑科提供。實驗動物：Wistar大白鼠150只，雌雄各半，體重(200±20)g，一級標准，四川省醫學實驗動物合格證編號：醫動字24101116，泸州醫學院動物飼養科提供。實驗期間全部動物飼以標准顆粒飼料，飲用自來水。臨床試驗對象：急性荨麻疹患者為1998年10月至1999年3月我科住院患者，其中患者組20例，男8例，女12例，年齡12～72歲，平均年齡（39.2±2.7）歲，病期1～6d，平均2.6d，所有患者在采樣前3d均停止或不用抗組胺藥及免疫抑制劑，采樣前1周未用過皮質類固醇等。正常人對照組20例，均為體檢正常人，性別與治療組相同，年齡相差不超過3歲。實驗試劑及儀器設備：Hanks液，pH為7.2，EDTA的質量濃度為0.5g/L，天花粉為致敏原，溶劑為市售質量分數為4％～5％氫氧化鋁凝膠，臨時用5mg天花粉溶於1mL氫氧化鋁凝膠溶解。L2T2台式電動離心機（上海八二二廠產），TG328A型光學讀取分析天平（清華天平儀器廠生產）；T21型分光光度計（四川分析儀器廠產）。（二）實驗方法：1.肥大細胞脫顆粒實驗：取上述未用藥大白鼠6只，斷頭取血並收集血清。隨機將大白鼠分為抗敏組、赤芍組、地龍組、甘草組、赤芍＋甘草組、赤芍＋甘草＋地龍組、空白組。每組10只，按5mL/kg，每日1次於晨8時灌胃，分別於第6、7、8、9、10天每組各取2只，腹腔按10mL/kg注射上述天花粉氫氧化鋁凝膠，20min後，右腹腔內注射上述Hanks液（注射前加熱）15～20mL，輕揉腹部2min後，脫頸椎處死大鼠，打開腹腔，用毛細吸管收集腹腔液（富含肥大細胞）於離心管中，2000r/min離心15min，棄上清液用含大白鼠血清的Hanks液洗滌1次，離心棄上清液，加入含25％大白鼠血清的Hanks液洗滌1次，離心棄上清液，加入含25％大白鼠血清的Hanks液1mL混勻，制成肥大細胞懸液觀察。取制備的肥大細胞懸液1滴於載玻片上，蓋上塗有中性紅染液的蓋片，在高倍顯微鏡下觀察，正常肥大細胞為正圓形，邊緣整齊；脫顆粒的肥大細胞邊緣不整齊或細胞破裂，有顆粒自細胞漿溢出，隨機計數100個細胞，計數脫顆粒細胞數及脫顆粒百分數。電鏡觀察，取大白鼠的小腸系膜，用2.5％戊二醛預固定2h，磷酸鹽緩沖液漂洗3次，1％四氧化二锇固定1h，丙酮梯度脫水。Epon－618環氧樹脂包埋，超薄切片機切片，JEOL－10ESX透射電鏡觀察，加速電壓80kV，放大倍數8000倍。2.被動皮膚過敏反應試驗：抗血清的制備：取4只未用藥（200±30）g大白鼠，將上述天花粉氫氧化鋁凝膠混懸液腳掌注射，每個腳掌注射0.1mL，每只大白鼠0.4mL，15d後，斷頭取血離心得抗血清。將上述取得的抗血清稀釋10倍。另取上述用藥各組大白鼠8只，剪去背部的毛，選2點，每點皮內注射上述抗血清0.1mL，48h後進行抗原攻擊，尾靜脈注射天花粉10mg/kg，天花粉用1％伊文思藍溶液配成1mg/kg。20min後斷頭處死動物，翻轉背部皮膚，將藍色反應斑皮片剪下，剪碎加入丙酮－生理鹽水（7∶3）混合溶液6mL浸泡，次日過濾並離心，在波長610nm處測吸光度A值。3.實驗室檢測：急性荨麻疹患者口服抗敏口服液10mL，日3次，共治療7d。於治療前後各取患者血清，采用雙抗體夾心ELISA法檢測IL－2及IL－4，ELISA藥盒購自深圳晶美生物有限公司。首先分別將標准品IL－2稀釋為1000、500、250、125、62.5、0pg/mL，IL－4稀釋為375、187.5、93.75、46.88、23.44、0pg/mL，分別將稀釋後的標准品及標本加入已用抗體IL－2，IL－4單抗預包被的聚苯乙烯反應小孔內，每孔100μL，用封板膠紙封住反應孔，37℃，90min，用PBS洗5次，每孔加生物素標記二抗100μL，封住板孔，37℃，60min。PBS洗板5次，再加稀釋好的酶聯物100μL，封住板孔，37℃，30min。PBS洗板5次，每孔加底物A、B各50μL，或1滴，避光37℃，15min。每孔加終止液50μL或1滴混勻，即刻用Bio－Rad公司生產的酶標儀在波長450nm處測其吸光度A值，用直線回歸分析，求出其標准方程，計算待檢血清中IL－2、IL－4的含量，單位為pg/mL。結果一、肥大細胞脫顆粒實驗1.各組肥大細胞脫顆粒百分數：從表1可見，抗敏組的肥大細胞脫顆粒百分數與其它各組相比最小，空白組與其它各組相比最大，其它各組也較高，各組與抗敏組比較，差異均有顯著性（P＜0.01），說明抗敏口服液可以有效抑制肥大細胞脫顆粒。2.被動皮膚過敏實驗：抗敏組的A值最小為0.08±0.04，顯著低於赤芍組(0.32±0.09)、地龍組(0.21±0.14)、甘草組(0.25±0.16)、赤芍＋甘草組(0.24±0.02)、赤芍＋甘草＋地龍組(0.28±0.08)及空白組(0.48±0.06),經t檢驗，P均＜0.01。二、臨床試驗檢測結果見表2。治療前，荨麻疹患者與健康人比較IL－2明顯降低，IL－4明顯升高，P均＜0.01。經抗敏口服液治療後荨麻疹患者IL－2、IL－4趨於正常，與正常人比較，P＞0.05。治療前後比較，差異均有顯著性(P＜0.05)。表1藥物對肥大細胞脫顆粒數的影響組別喂藥天數q值P值6d7d8d9d10d抗每組2219141111--赤芍組80887170723.67＜0.01地龍組86838079724.55＜0.01甘草組76747176713.93＜0.01赤芍+甘草組72707070673.11＜0.01赤芍+甘草+地龍組51545950361.04＜0.01空白組88759191935.43＜0.01表2急性荨麻疹患者用抗敏2口服液治療前後IL-2、IL-4水平比較例數IL-2IL-4急性荨麻診組20治療前173.3±49.798.8±13.0治療後519±14.232.7±8.9正常人20520±14934.3±8.6討論從肥大細胞實驗中，我們可以發現抗敏口服液對肥大細胞脫顆粒有明顯的抑制作用。被動皮膚過敏反應實驗提示，抗敏口服液無論與其拆方或空白組相比，其對抗原抗體的結合都有明顯抑制作用。因此，其具有明顯的抗Ⅰ型變態反應的作用，並且隨著時間的延長，作用加強。實驗室檢測方面：檢測結果發現荨麻疹患者IL－4含量顯著高於正常對照組，經抗敏口服液治療後IL－4含量明顯下降，而與正常人組比較，差異無顯著性，說明抗敏口服液可能是通過降低IL－4來治療荨麻疹患者。IL－2系T淋巴細胞活化過程中由細胞膜所分泌的一種糖蛋白，具有促進T細胞、B細胞、NK細胞增生、分化、增強效應，細胞活化，誘導干擾素產生及免疫調節等多種功能。同時也是T細胞活化標志之一。BenSasson[1]等認為T淋巴細胞產生IL－4需要IL－2，IL－2可上調IL－4誘導IgE合成。但相反的報道[2]認為IL－2能抑制正常人和過敏患者外周血單一核細胞，由IL－4誘導IgE合成。我們的研究表明荨麻疹患者發作期血清IL－2水平顯著低於正常人對照組（P＜0.01）。荨麻疹患者由於IL－2水平下降，使IL－2對IL－4促進B細胞合成IgE的抑制作用被減弱，使IgE合成增強。經抗敏口服液治療後荨麻疹患者IL－2趨於正常，治療前後比較，差異有顯著性，治療後與正常人比較差異無顯著性（P＞0.05），說明抗敏口服液的治療機理之一是升高IL－2。這也解釋了臨床上服抗敏口服液患者一般情況改善，抵抗力增加的問題。

        我們在臨床上應用抗敏口服液治療急性荨麻疹，取得了較好療效。為進一步探討其治療機理，我們做了細胞因子的實驗。通過以上分析，我們可以得知，抗敏口服液可以通過調整細胞因子來治療荨麻疹，這為治療過敏性疾病提供了一條有效的途徑。