表皮生長因子對游離毛囊生長的影響

表皮生長因子對游離毛囊生長的影響

中華皮膚科雜志 2000年第2期第33卷 論著

作者：楊淑霞　鐘志紅　秦儉　馬聖清　武玲慎

單位：楊淑霞（100034　北京醫科大學第一醫院皮膚科）；鐘志紅　秦儉　馬聖清　武玲慎（100034　北京醫科大學第一醫院皮膚科）

關鍵詞：毛囊；器官培養；表皮生長因子－尿抑胃素

　　【摘要】目的　通過毛囊器官培養觀察表皮生長因子（EGF）對人頭皮毛囊生長的影響。方法　用WilliamsE無血清培養基進行人頭皮毛囊游離培養，分為2組，EGF組（43根）和對照組（43根）。結果　EGF20μg/L組在加藥後1～3d毛干平均生長0.22mm/d，對照組平均生長0.16mm/d，兩組差異有顯著性（P＜0.05），EGF對毛囊生長有更明顯的促進作用。但EGF組毛囊於培養的第4～6天即出現退行期的形態改變並發生扭曲，毛干停止生長，對照組於培養第10天後才發生形態變化。組織學上，培養第10天EGF組毛囊下部外毛根鞘增厚，杵狀結構形成，而對照組仍為生長期形態。3H－亮氨酸摻入實驗顯示EGF組毛囊上皮中的放射活性（370c/min）高於對照組（271.14c/min）(P＜0.05)，而毛干中的放射活性（173.19c/min）與對照組（158.49c/min）無明顯差異。結論　EGF對毛囊的生長有促進作用，主要是促進毛囊上皮的生長，並且誘導毛囊提前由生長期進入退行期。

Effects of Epidermal Growth Factor on Human Hair Follicle Growth in vitro

YANG Shuxia,ZHONG Zhihong,QIN Jian, et al.

　　（Department of Dermatology, The First Hospital of Beijing Medical University, Beijing 100034）

　　【 Abstract】 Objective To investigate the effects of epidermal growth factor (EGF) on hair follicle growth. Methods Cultured human hair follicles were divided into two groups: EGF-treated group (EGF 20 ng/mL) and control group. The length and morphology of follicles were measured by inverted microscope daily. 3H-leucine incorporation and histologic studies were applied. Results The rates of hair shaft and hair follicle elongation significantly increased in the EGF-treated group during day 1 to day 3 in comparison with the control group. Histologically, the cells of the lower outer root sheath were thickened and club hair-like structure was formed. 3H-leucine incorporation showed that the radioactivity in hair follicle epithelium was higher in EG-treated group (370 c/min)than that in control group(271.14 c/min) (P＜0.05). No difference was found in terms of the radioactivity in hair shaft between EGF-treated group(173.19 c/min) and control group(158.49 c/min). Conclusion It is suggested that EGF might stimulate the growth of hair follicle epithelium, and induce anagen transforming into catagen prematurely.

　　【 Key words】 Hair follicle Organ culture Epidermal growth factor-urogastrone

　　毛發生長周期的調節是一個復雜的生理生化過程，該過程尚不完全清楚。現有的研究表明在毛囊的發生和生長過程中，表皮與間質間的相互作用是十分重要的，而這種相互作用可能是通過可彌散的分子，細胞與細胞間相互作用和細胞外基質介導的[1,2]。表皮生長因子（EGF）可能參與毛發生長與生長周期的調節^[3,4]。我們采用游離毛囊培養和3H－亮氨酸摻入實驗探討EGF對人頭皮毛囊的生長、形態和蛋白質合成的影響。

　　材料和方法

　　(一)材料：

　　1.標本來源：18～35歲新鮮屍體頭皮。

　　2.儀器：解剖顯微鏡（北京泰克儀器有限公司），倒置顯微鏡（Olympus），CO₂孵箱（Queue）。

　　3.培養基與試劑：WilliamsE培養基（Gibco）加谷氨酰胺2mmol/L，Hepes2mmol/L，氫化可的松10μg/L，牛胰島素（Sigma）10mg/L，轉鐵蛋白（Sigma）10mg/L，亞硒酸鈉（北京朝陽中聯化工試劑廠）10μg/L，青霉素10×10⁴U/L，鏈霉素100mg/L。EGF(Sigma)20μg/L。

　　(二)方法：

　　1.毛囊器官培養：參照Philpott^[5]的方法。選生長期毛囊分置於24孔板中，每孔1根，WilliamsE無血清培養基中培養。於培養第1天選取形態完好、生長速度與生理生長速度相似的毛囊（即1d內生長約0.3mm以上的毛囊）86根，分成兩組：EGF組和對照組各43根，EGF組培養基中加入EGF（20μg/L）。每組各16根毛囊每天在倒置顯微鏡下觀察毛囊形態並測量毛囊長度。游離培養的毛囊兩端的最遠距離記為毛囊長度，從毛干基底到毛干游離端記為毛干長度。

　　2.組織學檢查：培養第10天，EGF組和對照組各取2根毛囊，10％福爾馬林固定24h，石蠟包埋，切片，HE染色，觀察毛囊組織學形態。

　　3.3H－亮氨酸摻入：參照Harmon^[6]的方法，於加入EGF培養24h後，EGF組和對照組各選取25根毛囊，每5根置於1個孔中，加入3H－亮氨酸2μCi/mL，繼續培養48h後將毛囊移至1mL離心管中，分別用PBS和5％三氯醋酸（TCA）洗2次，蒸餾水洗1次，然後加入1mL0.3NNaOH37℃孵化18h。離心取上清液，測定可溶於鹼蛋白（ASP）部分，即毛囊上皮成分的放射活性。沉澱主要為未溶解的毛干，用0.3NNaOH洗4次，然後與0.5mol/LNaBH4＋1NNaOH50℃孵化48h，待毛干完全溶解，加入適量鹽酸中和，用以測定毛干蛋白（HFP）中的放射活性。使用液閃計數儀進行放射活性測定。

　　5.統計學分析：采用SPSS統計軟件進行t檢驗。

　　結果

　　(一)毛囊生長情況：（圖1）EGF（20μg/L）組於加藥後第1～3天毛干平均生長0.22mm/d，對照組平均生長0.16mm/d，兩組比較差異有顯著性（P＜0.05）。EGF組毛干第4天後生長速度明顯減慢，第5天時61.5％停止生長，平均總生長天數為7.6d，而對照組直至第10天後還在繼續生長，平均總生長天數為14d。EGF組毛囊和毛干的延長不完全一致，毛囊保持較快的延長速度至第6天，然後生長減慢，第8天時61.5％停止生長，平均生長天數為9.8d，培養10d總生長長度為1.28mm，比毛干（0.82mm）多（P＜0.05）。而對照組毛囊與毛干的生長基本是一致的，培養第1～3天平均生長速度分別為0.15mm和0.16mm，培養10d平均總生長長度分別為0.96mm和1.02mm。

圖1　表皮生長因子對毛囊及毛干生長的影響

圖2　EGF對毛囊形態的影響.a培養第5天對照組毛囊形態,b培養第5天EGF組毛囊形態，c培養第8天ECF組毛囊形態，同時可見貼壁生長的上皮細胞

圖3　ECF對毛囊形態的影響。a:對照組毛囊b:ECF組毛囊（×250）

　　(二)毛囊形態：倒置顯微鏡下觀察，EGF組毛囊形態在培養第1、2天未見明顯改變，第4～6天出現退行期改變，毛干基底向上移，與毛乳頭距離拉長，形成杵狀發，與毛乳頭間有一細胞索相連，第5天後部分毛囊下部出現彎折扭曲，並縮短。外毛根鞘細胞常貼壁生長（見圖2b和c）。對照組毛囊直至培養第10天後才出現形態改變，未發現外毛根鞘細胞貼壁生長。

　　組織學表現：培養第10天EGF組示毛母質中黑素明顯減少，毛囊下部外毛根鞘增厚，毛干基底杵狀結構形成,並與毛乳頭間拉開距離（見圖3b）。對照組毛囊結構清晰，毛母質包裹毛乳頭，未見外毛根鞘增厚（見圖3a）。

　　(三)毛囊蛋白質合成：液閃計數儀計數，可溶於鹼蛋白部分（毛囊上皮）放射性活性，EGF組平均為370.00c/min，對照組平均為271.14c/min，兩組差異有顯著性（P＜0.05），說明EGF組毛囊上皮蛋白質的合成較對照組高；毛干蛋白部分放射性活性，EGF組平均為173.19c/min，對照組平均為158.49c/min，兩組差異無顯著性。

　　討論

　　眾多的生長因子中，EGF倍受關注。研究證明EGF不僅在毛囊的形成和發育中有重要作用，還可能參與了毛發生長和生長周期的調節^[1－3]。利用免疫組織化學染色和放射自顯影研究顯示成熟的毛囊外毛根鞘（ORS）內有EGF和大量EGF受體存在^[2]。也有實驗顯示EGF可以誘導體外游離培養的人頭皮毛囊或羊的毛囊發生類似於動物實驗中羊毛的改變，使毛囊提前停止生長，進入退行期^[3,4,7]，而且使DNA的合成模式發生變化，對外毛根鞘細胞的DNA合成有明顯的促進作用^[3,7]。

　　本實驗中，形態學和組織學檢查顯示EGF組毛囊提前發生退行期樣改變，毛干基底和毛乳頭的距離拉長，杵狀發形成，毛囊下段發生彎折扭曲，部分毛囊下段縮短；而對照組未發生典型的退行期樣改變。這顯示，毛囊的退行變和EGF的作用是直接相關的。因為EGF受體主要位於毛囊的外毛根鞘內，故EGF可能是與外毛根鞘細胞上的受體結合後，引起外毛根鞘細胞的生長、合成與分泌活動的變化，從而干擾毛囊的正常生長，導致退行變。本實驗結果中，EGF組毛囊與對照組不同，毛囊的延長超過毛干的延長，毛囊上皮中蛋白質的合成明顯多於對照組，說明EGF對毛囊上皮成分有明顯的促進作用，與文獻相符。但本實驗未證明EGF是否影響毛囊外毛根鞘細胞的合成、分泌等功能。由於EGF誘導體外培養毛囊的退行期改變與生理狀態的退行期改變不完全相同，如看不到玻璃膜的增厚等，故毛發周期的調節是由EGF和其他眾多因素共同參與的復雜經過。本實驗說明EGF促進毛囊的生長，主要是毛囊上皮細胞的生長，並能誘導毛囊提前由生長期進入退行期。

　　寶潔公司資助課題

　　參 考 文 獻

　　1，Messenger AG. The control of hair growth : an overview. J Invest Dermatol, 1993, 101(Suppl): 4S－ 9S.

　　2，Moore GPM, Du Cross DL, Isaacs K, et al. Hair growth induction: roles of growth factors. Ann NY Acad Sci, 1991, 642:308－ 325.

　　3，Philpott MP, Kealey T. Effects of EGF on the morphology and patterns of DNA synthesis in isolated human hair follicles, J Invest Dermatol, 1994, 102: 186－ 191.

　　4，Hoffmann R, Eicheler W, Huth A,et al. Cytokines and growth factors influence hair growth in vitro. Possible implications for the pathogenesis and treatment of alopecia areata. Arch Dermatol Res, 1996, 288:153－ 156.

　　5，Philpott MP, Green MR, Kealey T. Human hair growth in vitro. J Cell Sci, 1990, 97: 463－ 471.

　　6，Harmon CS, Nevins TD. Hair fibre production by human hair follicles in whole－ organ culture. Br J Dermatol, 1994,130: 415－ 423.

　　7，Bond JJ, Wynn PC, Moore GP. Effects of epidermal growth factor and transforming growth factor alpha on the function of wool follicles in culture. Arch Dermatol Res, 1996, 288:373－ 382.

收稿日期：1999－05－31