干細胞因子在毛囊上皮細胞中的表達

干細胞因子在毛囊上皮細胞中的表達

　　第三軍醫大學學報1999年第21卷第12期

呂中法　劉榮卿　伍津津　唐書謙　葉慶佾

　　提　要　目的：為了解毛囊上皮細胞在體內是否表達干細胞因子(SCF)。方法：本文采用免疫組化和原位雜交技術，對毛囊上皮細胞中的干細胞因子表達情況進行檢測。結果：編碼干細胞因子的基因在毛囊上皮中部的局限區域表達特別明顯，在毛囊上下部位的上皮表達則明顯減弱，二者之間有顯著差異(P＜0.05)；而干細胞因子蛋白則在毛囊上皮細胞中普遍表達，說明干細胞因子在毛囊上皮中的表達，在分子和蛋白水平是有區別的。結論：毛囊干細胞可能定位於毛囊上皮的中部區域。

　　關鍵詞：毛囊　干細胞因子

　　毛囊真表皮間相互作用的研究是毛囊細胞生物學研究的熱點，細胞因子在介導真表皮細胞間的生物學活動中起重要作用^［1］。干細胞因子(Stem cell factor，SCF)是近年來發現的一種與造血干細胞等多種細胞的生長發育相關的細胞因子，對角朊細胞、黑色素細胞的生長發育和色素合成等也具有重要的調節作用^［2，3］。為了觀察毛囊上皮細胞在體內是否表達SCF，我們應用原位雜交和免疫組化技術，對正常人毛囊上皮細胞中的SCF表達情況進行了檢測。

　　1　材料與方法

　　1.1　標本采集

　　取外觀正常的枕部頭皮，標本來自18～35歲腎移植用屍體頭皮，共4例，男女各2例。頭皮取下後迅速置冰瓶中送冰凍切片，切片厚4μm和20 μm2種，前者風干用於做免疫組織化學染色；後者用4%多聚甲醛固定，用於原位雜交分析。

　　1.2　SCF cDNA探針的制備

　　SCF重組質粒由本科徐小珂博士惠贈。SCF片斷為0.5 kb。將重組質粒轉染大腸桿菌，進行質粒擴增，鹼變性提取質粒DNA，用限制性內切酶EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶切質粒DNA，電泳鑒定，電洗脫法回收cDNA探針，用地高辛試劑盒(德國Boehringer Mannheim)標記SCF cDNA探針。

　　1.3　原位雜交

　　切片在4%多聚甲醛中固定2～4h，PBS漂洗，在2μg/ml的蛋白酶K中37℃30 min，PBS漂洗，把切片移入含0.5 μg/ml SCF探針雜交液的EP管中，42℃20～24 h。雜交後依次用4×SSC、2×SSC、1×SSC、0.5×SSC和PBS漂洗，將切片移入1∶1　000的抗地高辛抗體反應液中，室溫12 h，PBS、TSM1、TSM2依次漂洗。加入NBT/BCIP顯色4 h，終止顯色，二甲苯透明、封片。結果判斷：以RNA酶預處理過的切片為陰性對照，胞漿出現淡藍色顆粒為(+)，深藍色顆粒(++)，紫藍色顆粒為(+++)；計數：在×400顯微鏡下，於每個毛囊的上、中、下部各選擇10個視野，計算每個視野的細胞數，共計10個毛囊，取其均值。

　　1.4　免疫組織化學染色

　　按S-P試劑盒(購自福建麥新生物工程公司)介紹的步驟進行。SCF單抗由徐小珂博士惠贈。4μm厚的冰凍切片4℃丙酮固定10 min，SCF單抗稀度為1∶80。DAB顯色。以PBS代替一抗作為陰性對照。結果判斷：胞漿內出現黃色或棕黃色顆粒(+)，棕色顆粒為(++)，褐色顆粒為(+++)，計數方法同原位雜交。

　　2　結果

　　2.1　毛囊上皮細胞的SCF mRNA原位雜交結果

　　4例標本正常頭皮的切片中，SCF mRNA表達陽性，呈淡藍色或藍色顆粒，尤其在毛囊上皮中部的局限區域表達特別明顯，呈++～+++，其它部位表達呈+或陰性，見圖1。毛囊中部上皮細胞的SCF mRNA表達結果與毛囊上、下部有明顯區別，見表1。陰性對照均無染色。

表1　毛囊上皮細胞SCF mRNA的表達情況(陽性細胞數)

　　Tab 1　Expression of SCF mRNA in epithelium of hair

　　follicle(Number of positive cells)

　 + ++ +++ Upper region 12.8±3.6 　3.2±1.5^* 0 Middle region 0 25.8±3.9 22.5±2.3 Lower region 13.3±4.1 　2.8±1.7^* 0

*:P＜0.01 vs middle region

圖1　干細胞因子在毛囊上皮細胞中的原位雜交結果　(×100)

　　fig 1　In situ hybridization of the gene encoded SCF in the epithelium of hair follicle　(×100)

　　2.2　毛囊上皮細胞的SCF蛋白E表達結果

　　4例標本正常頭皮的全部切片其SCF雜色均陽性，呈+～++，無明顯局部表達增強的特征，見圖2。陰性對照均無染色。

圖2　干細胞因子在毛囊上皮細胞中的免疫組化染色結果　(S-P×200)

　　fig 2　Results of expression of SCF protein in tbe epithelium of hair follicle by immunocytochemistry　(S-P×200)

　　3　討論

　　毛囊是一個具有生長、退行、休止3個階段周期性循環的皮膚附屬器，由上皮和真皮2部分組成。毛囊真表皮間相互作用在毛囊生長周期的調控中起重要作用。細胞因子是介導真表皮間的生物學活動的重要分子，很多研究顯示EGF、bFGF等細胞因子參與毛囊的發生、生長和生長周期的調控^［4，5］。SCF是近年來發現的一種與造血干細胞的增殖分化相關的細胞因子；並發現其對角朊細胞、黑色素細胞的生長發育也有明顯的調控作用。本文檢測了SCF在毛囊上皮細胞中的表達情況，發現編碼SCF的基因在毛囊上皮中部的局限區域細胞表達特別強烈，明顯強於其上下部位的毛囊上皮細胞，提示該部位部分毛囊上皮細胞表達SCF mRNA較強。文獻^［6］報道，小鼠毛囊干細胞位於毛囊的隆突部，而在人頭皮，毛囊形態上無明顯隆突部，通過克隆分析方法認為毛囊干細胞位於毛囊中部立毛肌附著處^［7］。我們的結果是否對毛囊干細胞的定位具有提示作用，尚需進一步研究。

　　免疫組化染色結果表明，毛囊上皮細胞有比較一致的SCF蛋白表達，無局部表達增強現象，說明毛囊上皮細胞中SCF在分子和蛋白水平的表達是有區別的，Grabble等^［2］檢測正常表皮角朊細胞的SCF m-RNA表達情況，發現正常角朊細胞有SCF的表達，其中以基底細胞和棘層下部的角朊細胞表達較為明顯。基底細胞是表皮的生發細胞，本文結果提示毛囊干細胞可能定位於毛囊上皮的中部區域。

　　基金項目：國家自然科學基金資助項目(39500131)

　　foundation item: National Natural Science Foundation of China(39500131)

　　作者簡介：呂中法，男，1967.05.01生，浙江省永康縣人，博士，主治醫師，現在附屬新橋醫院皮膚科，主要從事毛囊重建方面的研究，發表論文8篇。電話：(023)68755687

　　作者單位：第三軍醫大學附屬西南醫院皮膚科，重慶 400038

　　參考文獻

　　［1］　Jahoda C A, Reynolds A.Dermal-epidermal interactions.Adult follicle-derived cell populations and hair growth［J］.Dermatol Clin,1996,14(4):573-578.

　　［2］　Grabbe J, Welker P, Rosenbach J, et al.Release of stem cell factor from a human keratinocyte line, HaCat, is increased in differentiating versus proliferating cells［J］.J Invest Dermatol,1996,107(2):219-222.

　　［3］　Funasaka Y, Boulton T, Cobb M, et al.C-kit-kinase induces a cascade of protein tyrosinephosphorylation in normal human melanocytesin response to mast cell growth factor and stimulates mitogen-activated protein kinase but is down-regulated in melanomas［J］.Mol Biol Cell,1992,3(2):197-201.

　　［4］　Peus D, Pitteikow M R.Growth factors in hair organ development and the hair growth cycle［J］.Dermatol Clin,1996,14(4):559-563.

　　［5］　Rosenquist T, Martin G R.FGF signaling in the hair growth cycle: Expression of the FGF receptor and ligand genes in the murine hair follicle［J］.Dev Dyn,1996,205(4):379-382.

　　［6］　Lavker R M, Miller S, Wilson C, et al.Hair follicle stem cells: Their location, role in hair cycle, and involvement in skin tumor formation［J］.J Invest Dermatol,1993,101(1 Suppl):16s-19s.

　　［7］　Rochat A, Kobayashi K, Barrandon Y.Location of stem cells of human hair follicles by clonal analysis［J］.Cell 1994,76(6):1063-1068.