CEBPs在不同發育階段人毛囊-皮脂腺單位中的表達與意義

鄭業華 楊 恬 高強國 2005-12-13 13:00:58 中華實用醫藥雜志 2004年9月第4卷第17期

       【摘要】 目的 尋找不同發育階段人毛囊-皮脂腺單位中C/EBPα和C/EBPβ的表達變化規律及與毛囊皮脂腺分化的關系。方法 應用免疫組化方法檢測胚胎及新生兒和成人毛囊皮脂腺組織中C/EBPα和C/EBPβ的定位及表達。結果 C/EBPα和C/EBPβ分別在胚胎期毛囊外根鞘，毛乳頭，毛母質及皮脂腺細胞的胞核內強表達;新生兒毛囊峽部下端外根鞘基底層細胞的胞核內也存在強表達，基底內層胞核陽性信號逐漸減弱;而成體毛囊核內陽性信號僅定位於峽部下端外根鞘基底層及皮脂腺基底層。毛囊外根鞘內層細胞隨分化程度升高，胞漿內C/EBPα和C/EBPβ的表達逐漸升高，毛乳頭細胞則未見陽性顆粒。在整個毛囊皮脂腺發育過程中C/EBPα的表達都略強於C/EBPβ。結論 C/EBPα和C/EBPβ在不同發育階段的毛囊皮脂腺單位中均有表達，定位及表達水平與分化程度密切相關。

　　關鍵詞 毛囊-皮脂腺單位 C/EBPs 分化

　　Characteristics of C/EBPs protein expressions in the pilo-sebaceous unit  of human at different developmental stage and 　　their biological significance 

　　Zheng Yehua，Yang Tian，Gao Qiangguo

     Department of Cell Biology，Third Military Medical University，Chongqing400038.

    【Abstract】 Objective To study the expression of C/EBPαand C/EBPβprotein in human piol-sebaceous uˉnit during different developmental stage.Methods C/EBPαand C/EBPβprotein expressions were studied by using immunohistochemical method.Results C/EBPαand C/EBPβexpressed differently in the outer root sheath，follicular papilla，hair matrix and sebaceous gland in embryonic period.The positive signals were chiefly distributed in the nucleˉuses.The expression of C/EBPαand C/EBPβwere found in the basal cell layer of outer root sheath and sebaceous gland in the new born and maturation phase，The expression in nucleuses of outer root sheat cells decreased with the differentiation but enhanced oppositely in the cytoplasm.Ngetive stain was in the follicular papilla.Conclusion They are expressions of C/EBPαand C/EBPβprotein in human pilo-sebaceous unit at different stage.The expression level is closely correlated with the differentiation degree.This indicates that C/EBPs play important roles in the development of human pilo-sebaceous unit.Key words human pilo-sebaceous unit C/EBPs differentiation  

　　C/EBPs蛋白是一組耐熱的轉錄調控因子，能與啟動子CCAAT區及多種病毒增強子結合，在細胞增殖、分化、信號轉導及腫瘤發生、免疫反應、能量代謝等方面發揮重要作用。有實驗表明C/EBP家族在細胞分化，炎症反應及基因調控中扮演了關鍵角色 ［1］  。C/EBPs存在於表皮中，與角質形成細胞分化及生長停滯有關 ［2］  。但它們與毛囊皮脂腺的關系卻很少提到。我們檢測了C/EBPα、C/EBPβ在人不同發育時期的毛囊皮脂腺單位中的分布與表達，探討其與人毛囊皮脂腺單位生長發育的關系。

　　1 材料和方法

    1.1 材料 人胚胎（12～17周胎齡）、新生兒及成人正常頭皮標本各5例，取自西南醫院。標本去除皮下組織後立即用4%多聚甲醛固定，30%蔗糖脫水後切片備用。

    1.2 主要試劑 免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒購自北京中山生物試劑公司，兔抗人C/EBPα和C/EBPβ單克隆抗體為武漢博士德生物工程有限公司產品。

    1.3 免疫組織化學 標本在冰凍切片儀上連續切片，片厚8μm，載於多聚賴氨酸包被的玻片上，冰凍切片完全烘干後，1%H 2 O 2 甲醇封閉內源性過氧化物酶30min後依次加入正常工作血清15min，一抗（1:100，4℃過夜），二抗，S-P/HRP復合物，上述步驟間均以PBS緩沖液振洗3次，5min/次，DAB顯色，常規脫水，透明，中性樹脂封片，倒置顯微鏡觀察。

    1.4 結果判定 在400倍光鏡下觀察免疫組化結果，隨機選取5個視野，每個視野均觀察100個細胞，C/EBPα標記定位於細胞核和（或）漿內，呈棕黃色顆粒或均勻黃染。陽性判定標准按著色深度和范圍分:強陽性（+++），陽性細胞數>70%;中度陽性（++），陽性細胞數占30%～70%;輕度陽性（+），陽性細胞數占10%～30%;陰性（-），未見細胞著色。C/EBPβ陽性判定標准同C/EBPα。

    2 結果

　　在胚胎期（embryo，E）毛囊包括bulge區、外根鞘（outer root sheath，ORS）、毛球部（hari bulb）及皮脂腺（sebaceous gland，SG）中都存在強烈的C/EBPα與C/EBPβ的表達，陽性信號主要定位於外根鞘角質形成細胞、毛母質（hair matrix，HM）細胞、毛乳頭（dermal papilla，DP）細胞及皮脂腺細胞的胞核內。C/EBPα在新生兒（neonate，N）的毛囊主要表達在峽部下端外根鞘基底層細胞的胞核中，且在外根鞘內層細胞中核內陽性信號隨細胞分化程度升高而減弱，毛乳頭與毛母質細胞均呈中度陽性，同時皮脂腺細胞也存在C/EBPα強表達特別是其基底層細胞的胞核;C/EBPβ在毛球部表達呈弱陽性，在外根鞘呈中度陽性且主要表達在其基底層（圖 1、2）。在成人（adult，A）毛囊E/EBPα與E/EBPβ的表達明顯 減弱，陽性信號主要分布在毛囊峽部外根鞘角質形成細胞及毛球部的毛母質細胞的胞漿內，毛乳頭細胞為陰性，皮脂腺基底層細胞的胞核呈強表達，同時在毛囊內層的胞漿表達量隨細胞分化程度升高而增強（圖3）。在整個毛囊發育過程中C/EBPα的表達都略強於C/EBPβ。ORS、HM、DP、SG胞核和胞漿中的表達程度見表1和表2。表1 C/EBPs在毛囊皮脂腺單位各類型細胞胞核中的表達(略）

　　3 討論

　　C/EBP即CCAAT/增強子結合蛋白，得名於其具有激活特定基因DNA增強子CCAAT重復序列的功能，這種轉錄因子共有7種亞型α、β、δ、γCRP1等，它們的分子結構中含有一個鹼性轉錄激活區和一個亮氨基酸拉鏈模體，可形成同源或異源二聚體，通過DNA結合區結合於靶基因的調控元件。C/EBPs以組織和階段特異性方式表達，調控大量組織中的細胞分化，如肝、脂肪組織、血管細胞、內分泌腺。近來，有實驗發現C/EBPα、C/EBPβ、C/EBPδ在表皮中表達參與角質形成細胞分化和生長抑制，在表皮角阮細胞中C/EBPα和C/EBPβ能下調分化標記蛋白;外殼蛋白、角蛋白1和10的表達 ［3］  。還有實驗證明C/EBPα和C/EBPβ在鼠的生長期毛囊的內、外根鞘、皮脂腺、bulge區，真皮乳頭和毛母質細胞中均有表達 ［4］  ，說明它們參與了角質形成細胞的終末分化並調控毛發周期中重要基因的表達。在本實驗中我們通過免疫組化研究了C/EBPα、C/EBPβ在人不同發育階段的特異表達，了解其與人毛囊皮脂腺生長分化的關系。我們的實驗結果發現C/EBPα和C/EBPβ在胚胎期毛囊發育階段突出表達在bulge區（毛囊干細胞聚集區），外根鞘，毛乳頭及皮脂腺細胞的胞核內，說明在毛囊上皮分化過程中基因的表達調控可能有C/EBP的參與，根據既往實驗發現它們可能通過細胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子p21（wafl/cipl）起作用 ［5］  ，p21（wafl/cipl）的表達能引起細胞周期G1期阻滯，促進細胞分化成熟。在p21上游存在有轉錄因子C/EBPα和C/EBPβ的DNA結合區，它們可能通過與p21結合，調節p21基因的表達，從而導致毛囊上皮細胞分化。同時我們的實驗還發現在成體毛囊峽部以下球部以上外根    鞘角質形成細胞的胞核內C/EBP的表達較強，有文獻報道 此處細胞表達上皮干細胞的標志蛋白K19，從而提出此處是除立毛肌附著處外另一個干細胞儲蓄庫 ［6］  。C/EBP在此處的表達進一步證實，C/EBP在低分化細胞的胞核內作用，激活轉錄使細胞停止增殖，轉向分化。我們還發現隨著毛囊外根鞘細胞逐漸分化，核內C/EBP表達水平逐漸減弱，胞內C/EBP表達水平逐漸增強，這也進一步證實了以前一些研究發現;C/EBP在維持細胞分化狀態中起著重要作用。另外，我們發現C/EBPα、C/EBPβ在皮脂腺腺體邊緣細胞的胞核中強表達。C/EBPα、C/EBPβ是控制脂肪細胞分化和脂質形成的重要因子，如果我們假設皮脂腺細胞分化和脂質形成的機制與脂肪細胞相似 ［7］  。那麼C/EBPα、C/EBPβ也可能是調控皮脂腺細胞分化和脂質新陳代謝的重要因子。C/EBP蛋白對基因轉錄的調控是多層次、多因子、有一定時空次序的復雜精細調控，它們在毛囊皮脂腺分化過程中的作用研究仍然停留在初級階段，它們與哪些因子協同作用?通過何種信號途徑實現細胞間對話，調控毛囊皮脂腺中的基因轉錄?這些問題仍有待於進一步研究。（本文圖片見封三）

　　參考文獻

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　　作者單位:400038重慶第三軍醫大學基礎部細胞生物教研室

　　（收稿日期:2004-05-22）